RNA/DNA比值測(cè)定
1.所需藥品及方法：
1、0.6mol/L HClO4 溶液配制，市售HClO4 48.94mL溶于適量超純水中，定容至1000mL
0.2mol/L HClO4 溶液配制，市售HClO4 16.31mL溶于適量超純水中，定容至1000mL
2、0.05 mol/L pH=7.4 Tris-HCl 緩沖液配制，500mL 0.1mol/L Tris溶液+420.0mL HCl溶液混合，超純水定容至1000 mL。
3、0.3mol/L KOH 溶液配制，16.8g KOH固體溶于適量超純水，冷卻后定容至1000mL。
[測(cè)定方法]
1、把適量肌肉與緩沖液(0.05mol Tris_HCl,pH=7.4)混合勻漿,取1.4 mL勻漿液和0.7mL冷的HClO4（0.6mol/L）混合,于冰上冷卻15 min后,在4℃下離心(10000r/min)10 min,去掉上清液；
2、將沉淀用1.12mL KOH（0.3mol/L）的在37℃水浴1h后冰浴30 min,離心(方法同上)。取其上清液,于751G型分光光度計(jì)(上海分析儀器廠)上讀取260 nm處的吸光值,此為RNA在260 nm處的吸光值；
3、將沉淀用2.0mL冷的HClO4（0.2 mol/L）洗滌,離心,去掉上清液。在沉淀中加入2.2mL HClO4（0.6 mol/L）于85℃水浴中15 min后,再冰浴15 min,離心,取其上清液,在260nm處測(cè)吸光值,此為DNA在260nm處的吸光值。從而估測(cè)RNA/DNA的比值。
蛋白酶活力測(cè)定
1.所需藥品及方法
1、福林試劑，待購(gòu)。
2、0.55mol/L Na2CO3溶液，58.3g Na2CO3超純水溶解，定容至1000 mL。
3、10%三氯乙酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。
4、0.02 mol/L pH7.5磷酸緩沖液：
0.02M 磷酸氫二鈉溶液的配制：取Na2HPO4·2H2O 3.561g (或Na2HPO412H2O 7.164g)，溶解于1L蒸餾水中。0.02M 磷酸二氫鈉溶液的配制：取NaH2PO4 H2O 2.76g (或NaH2PO4 2H2O 3.121g)，溶解于1L蒸餾水中。
將0.02mol/L磷酸氫二鈉溶液84mL與0.02mol/L磷酸二氫鈉溶液16mL混合，即為0.02mol/L pH7.5磷酸緩沖液。
5、0.5％酪素：（酪蛋白）0.5克，以0.5 mol/L NaOH 1mL濕潤(rùn)。再加少量0.02M pH7.5磷酸緩沖液稀釋。在熱水浴中溶解，定容至100mL，冰箱中可保存一周。100mL。
[材料及實(shí)驗(yàn)器材]：
分光光度計(jì)、光徑1.0cm比色杯、離心管、電子天平、離心機(jī)、勻漿器、剪子、鑷子、冰塊、試管若干、移液管若干。
[實(shí)驗(yàn)步驟]
1、酶粗提液的制備
取新鮮肝胰臟、胃、腸組織稱重，在冰盤上剔除脂肪及內(nèi)容物，以10倍緩沖液或去離子水勻漿各組織，將組織懸液低溫下離心（3000rpm/min）,上清液為酶粗提液（酶液）。
2、酶活力測(cè)定
（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精確稱取烘干的酪氨酸50mg，加少量0.2N鹽酸溶解，定容至100mL，分別配制溶液0—100μg/mL不同濃度溶液，不同濃度各取酪氨酸溶液1mL，加0.5％酪素2mL，于37℃ 水浴中反應(yīng)15分鐘，然后加入三氯乙酸3mL，離心除去沉淀。取清液1mL，加入0.55mol/L碳酸鈉5mL，再加入福林試劑1mL，于37℃水浴顯色15分鐘，在680nm波長(zhǎng)下比色，測(cè)光密度（OD值）。以光密度讀數(shù)為縱坐標(biāo)，酪氨酸的微克數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制曲線。
（2）樣品測(cè)定
樣品測(cè)定設(shè)對(duì)照管和測(cè)定管。
|
對(duì)照管 測(cè)定管 |
|
適當(dāng)稀釋酶溶液 / 0.5mL 去離子水 0.5mL / |
|
37℃水浴預(yù)熱3---5分鐘 |
|
0.5%酪素（預(yù)熱過(guò)） 1mL 1mL |
|
37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)15分鐘 |
|
10％三氯乙酸 1.5mL 1.5mL |
|
離心去除沉淀 |
|
取上清液于另外試管內(nèi) 0.5mL , ; 0.5mL |
|
0.55mol/L碳酸鈉 2.5mL 2.5mL |
|
福林試劑 0.5mL 0.5mL |
37℃水浴顯色15分鐘，680nm波長(zhǎng)比色，以對(duì)照管校零，讀取測(cè)定管光密度。
3、計(jì)算
在37℃下每分鐘水解酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸為一個(gè)酶活力單位
蛋白酶的活力單位＝A/15×F
A為樣品測(cè)得光密度查曲線，得相應(yīng)酪氨酸μg數(shù)
F 為酶液最終稀釋倍數(shù)，15為反應(yīng)時(shí)間（min）
[方法評(píng)估]
福林—酚法測(cè)定蛋白酶活力是生產(chǎn)實(shí)踐和科學(xué)研究中應(yīng)用的基本實(shí)驗(yàn)方法。
[應(yīng)用意義]
水產(chǎn)動(dòng)物消化系統(tǒng)內(nèi)的消化酶隨動(dòng)物種類而異，而且消化酶的種類和在消化道中分布的差別是和動(dòng)物食性相適應(yīng)的。分析消化蛋白酶活力有助于了解動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)食物的消化能力，掌握動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需求。
[注意事項(xiàng)]
1、實(shí)驗(yàn)材料應(yīng)新鮮，不新鮮會(huì)發(fā)生組織自溶和酶原被破壞。
2、酶液與底物作用時(shí)間、作用溫度要嚴(yán)格控制，否則數(shù)據(jù)誤差很大。
3、酶液要用適當(dāng)緩沖液稀釋到測(cè)定光密度在0.2—0.6之間。
淀粉酶活力的測(cè)定
[目的與原理]
掌握淀粉酶活力的測(cè)定方法，測(cè)定水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物主要笑話器官的肝胰臟、胃、腸內(nèi)的淀粉酶活力。
淀粉酶催化淀粉扥子中葡萄糖苷鍵水解，產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖等。在基質(zhì)充分的條件下，反應(yīng)后加入的碘液與未被水解的淀粉結(jié)合成藍(lán)色的復(fù)合物，其藍(lán)色深淺與未經(jīng)酶促反應(yīng)的空白管比較吸光度，從而推算出淀粉酶的活力單位。
[試劑與器材]
1、0.2%可溶性淀粉
精確稱取可溶性淀粉1.00g ，置于20mL燒杯內(nèi)，加入蒸餾水25mL，搖勻使成為淀粉混懸液；稱取無(wú)水磷酸二氫鈉13.3g及苯甲酸4.3g，共置于500mL燒杯內(nèi)，加入蒸餾水越250mL，煮沸后，將淀粉混懸液倒入此杯內(nèi)，并用蒸餾水洗滌裝混懸液的燒杯數(shù)次，洗滌液亦倒入此燒杯內(nèi)，繼續(xù)煮沸1分鐘，冷卻至室溫后倒入500mL容量瓶中，并用蒸餾水稀釋至500mL刻度。此淀粉pH應(yīng)為7.0±0.1，在室溫下課保存2~3個(gè)月。
2、0.1mol/L 碘貯存液：精確稱取碘酸鉀（KIO3）0.3567g及碘化鉀（KI）4。5g置于100mL容量瓶?jī)?nèi)，加入蒸餾水80mL，然后緩慢加入濃鹽酸0.9mL，搖勻后用蒸餾水稀釋至100mL刻度，置于冰箱內(nèi)備用。
3、0.01mol/L碘應(yīng)用液：取上述碘貯存液50mL，用蒸餾水稀釋至500mL,盛于棕色瓶中置于冰箱內(nèi)，可保存1個(gè)月。
[實(shí)驗(yàn)材料及器材]
所采集樣品。分光光度計(jì)、電子天平、離心機(jī)、pH測(cè)定儀、恒溫水箱、勻漿器、剪子、鑷子、冰塊、50mL比色管若干、移液管若干，500mL容量瓶，燒瓶。
[實(shí)驗(yàn)步驟]
1、酶提取液的制備（同蛋白酶）
2、淀粉酶活力的測(cè)定
取50mL刻度比色管二只，表明為對(duì)照管，測(cè)定管。
|
|
對(duì)照管 |
測(cè)定管 |
|
2%可溶性淀粉 |
1.0ml |
1.0ml |
|
將兩管在37℃水浴中預(yù)熱2-5分鐘 | ||
|
酶液 |
— |
0.02mL |
|
測(cè)定管混勻后，再置于37℃水浴中反應(yīng)7.5分鐘 | ||
|
0.01mol/L碘應(yīng)用液 |
1.0mL |
1.0mL |
用蒸餾水稀釋至10mL，立即混勻。用660nm或紅色濾光板進(jìn)行比色，以蒸餾水校正光密度0點(diǎn)，讀取對(duì)照管和測(cè)定管光密度讀數(shù)。
3、計(jì)算
淀粉酶活力單位定義：在37℃、30min內(nèi)，100mL酶液中的淀粉酶能夠完全水解淀粉10mg稱為一個(gè)淀粉酶活力單位。
淀粉酶活力單位/100mL=（對(duì)照管光密度—測(cè)定管光密度）/對(duì)照管光密度×2/10×30/7.5×100/0.1=（對(duì)照管光密度—測(cè)定管光密度）/對(duì)照管光密度×800
[方法評(píng)估]
測(cè)定淀粉酶的方法有很多種，大致可以分為兩類：即測(cè)定底物（淀粉）的減少量和測(cè)定產(chǎn)物（如還原性糖）的生成量。本實(shí)驗(yàn)采用前者的淀粉—碘比色法。
[注意事項(xiàng)]
1、0.04%可溶性淀粉溶液5mL內(nèi)淀粉含量為2mg，在本法條件下，當(dāng)2mg淀粉完全水解時(shí)相當(dāng)于800淀粉酶單位/100mL（即：2/10×30/7.5×100/0.1=800）。
2、對(duì)照管內(nèi)含淀粉2mg，由于淀粉溶液比較穩(wěn)定，故對(duì)照管在固定比色計(jì)上的光密度讀書(shū)并不改變，因而在測(cè)定中不必每次作對(duì)照管。
3、當(dāng)酶液接近800單位時(shí)，由于淀粉已幾乎完全被水解，故加入碘液后也不再顯藍(lán)色，因此淀粉酶單位較高時(shí)（接近600單位）宜將標(biāo)本稀釋（2~5倍）后重新測(cè)定，并將測(cè)定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。
4、如淀粉溶液出現(xiàn)大量渾濁或者絮狀物，表示淀粉溶液污染或者變質(zhì)，不能再使用。
5、唾液內(nèi)含有大量的淀粉酶，故即使是唾液的飛沫污染，也能使測(cè)定結(jié)果顯著偏高。
脂肪酶活力的測(cè)定
[目的與原理]
掌握脂肪酶活力的測(cè)定方法，并測(cè)定魚(yú)、蝦、貝體內(nèi)消化器官肝胰臟、胃、腸的脂肪酶活力。
脂肪酶在一定條件下，將甘油三酯水解。在不同水解階段可分別產(chǎn)生脂肪酸、甘油二酯、甘油一酯及甘油。水解所產(chǎn)生的脂肪酸可以用標(biāo)準(zhǔn)的氫氧化鈉滴定，用滴定值表示酶活力。
[試劑與器材]
試劑：
1、聚乙烯醇(P. V. P.)橄欖油乳化液：稱取40克聚乙烯醇，加蒸餾水約1000mL，在小火上加熱，并不停攪拌，至聚乙烯醇全部溶解，冷卻后定容至1000毫升。用雙層紗布過(guò)濾，濾液備用；取4％聚乙烯醇溶液300毫升，加100毫升橄欖油，用高速組織搗碎機(jī)攪動(dòng)6分鐘，即成乳白色聚乙烯醇橄欖油乳化液，保存于低溫下（4℃）備用。 400
2、0.025mol/L磷酸緩沖液（pH7.5）
0.025mol/L磷酸氫二鈉溶液的配制：取Na2HPO4·2H2O 4.45g溶于1L蒸餾水中；
0.025mol/L磷酸二氫鈉溶液的配制：取NaH2PO4·H2O 3.45g（或NaH2PO4·2H2O 3.90g）溶于1L蒸餾水中。
將0.025mol/L磷酸氫二鈉84mL與0.025mol/L磷酸二氫鈉16mL混合，即為0.025mol/L磷酸緩沖液。 500
3、0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.5 1000
4、1％酚酞指示劑：取1g酚酞溶于100mL 70％乙醇溶劑中。 100
5、95％乙醇 1000
[實(shí)驗(yàn)材料與器材]
魚(yú)、蝦、貝的肝胰臟、胃、腸標(biāo)本。
勻漿器、離心機(jī)、恒溫水浴。高速組織搗碎機(jī)、酸式滴定管、滴定管架、鑷子、剪子、錐形瓶、移液管、燒杯。
[實(shí)驗(yàn)步驟]
1、酶粗提液的制備（見(jiàn)蛋白酶活力的測(cè)定）。
2、取100mL錐形瓶3個(gè)，一個(gè)作為對(duì)照組，另兩個(gè)為測(cè)定組
0.025M磷酸緩沖液（pH7.5） 5mL 5mL 5mL
聚乙醇橄欖油乳化液 4mL 4mL 4mL
用0.05mol/L標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉滴定至微紅色，記錄滴定消耗的NaOH體積（mL)數(shù)。
計(jì)算：
酶活力以國(guó)際單位表示，即在一定條件下，脂肪酶水解脂肪每分鐘產(chǎn)生1微克分子脂肪酸的酶量定為一個(gè)國(guó)際單位。
脂肪酶活力單位＝（A－B）N·f
t
式中： A為樣品耗堿液mL數(shù)， B為對(duì)照組耗堿液mL數(shù)
N為每毫升堿液微克分子數(shù)，f為稀釋倍數(shù)
t為作用時(shí)間 (分)
[應(yīng)用意義]
脂肪酶是動(dòng)物消化脂肪的重要酶類其分泌量和活力與動(dòng)物對(duì)脂肪的消化、吸收、利用有關(guān)。水產(chǎn)動(dòng)物肝胰臟或胰臟是脂肪酶的主要分泌器官，胃腸粘膜及肝臟亦能分泌，有的魚(yú)類幽門垂中脂肪酶活力最高。測(cè)定水產(chǎn)動(dòng)物各部位脂肪酶活力有助于研究、分析其對(duì)脂肪的消化能力及各部位消化功能狀況。