HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法
1、樣品量不足，解決辦法為增加樣品量
2、樣品未從柱子中流出。可根據(jù)樣品的化學性質(zhì)改變流動相或柱子
3、樣品與檢測器不匹配。根據(jù)樣品化學性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器
4、檢測器衰減太多。調(diào)整衰減即可。
5、檢測器時間常數(shù)太大。解決辦法為降低時間參數(shù)
6、檢測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。
7、檢測池中有氣泡。解決辦法為排氣。
8、記錄儀測壓范圍不當。調(diào)整電壓范圍即可。
9、流動相流量不合適。調(diào)整流速即可。
10、檢測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。
為什么HPLC柱柱壓過高
柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因。
1、拆去保護預柱，看柱壓是否還高，否則是保護柱的問題，若柱壓仍高，再檢查；
2、把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查；
3、將柱子的進出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動相沖洗柱子，（此時不要連接檢測器，以防固體顆粒進入流動池）。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查；
4、更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系。 一般情況下，在進樣器與保護柱之間接一個在線過濾器便可避免柱壓過高的問題，SGE提供的Rheodyne 7315型過濾器就是解決這一問題的最佳選擇。
液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？
1、篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。
2、存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子
如何解決HPLC進行分析時保留時間發(fā)生漂移或急速變化
漂移現(xiàn)象
1、溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定
2、流動相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動相發(fā)生蒸發(fā)、反應等
3、柱子未平衡好，需對柱子進行更長時間的平衡
快速變化現(xiàn)象
1. 流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設定流速，使之保持穩(wěn)定
2、泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。
3、流動相不合適，解決辦法為改換流動相或使流動相在控制室內(nèi)進行適當混合
HPLC 儀器問題
1、 我的HPLC泵壓明顯的偏高，請問可能的原因？
答：流速設定過高；流動相或進樣中有機械雜質(zhì)，造成保護柱、柱前篩板或在線過濾器阻塞；流動相粘度過大；柱溫過低；緩沖鹽結(jié)晶；壓力傳感器故障。
2、 基線不穩(wěn)，上下波動或漂移的原因是什么，如何解決？
答：a.流動相有溶解氣體；用超聲波脫氣15-30分鐘或用充氦氣脫氣
b.單向閥堵塞；取下單向閥，用超聲波在純水中超20分鐘左右，去處堵塞物
c.泵密封損壞，造成壓力波動；更換泵密封
d.系統(tǒng)存在漏液點；確定漏液位置并維修
f.柱后產(chǎn)生氣泡；流通池出液口加負壓調(diào)整器
g.檢測器沒有設定在最大吸收波長處；將波長調(diào)整至最大吸收波長處
h.柱平衡慢，特別是流動相發(fā)生變化時；用中等強度的溶劑進行沖洗，更改流動相時，在分析前用10-20倍體積的新流動相對柱子進行沖洗。
3、 接頭處為何經(jīng)常漏液，如何處理？
答：接頭沒有擰緊；擰松后再緊，手緊接頭以手勁為限，不要使用工具，不銹鋼接頭先用手擰緊，再用專用扳手緊1/4-1/2圈，注意接頭中的管路一定要通到底，否則會留下死體積。接頭被污染或磨損；建議更換接頭。接頭不匹配，建議使用同一品牌的配件。
4、 進樣閥漏液是如何造成的？
答：a.轉(zhuǎn)子密封損壞；更換轉(zhuǎn)子密封
b.定量環(huán)阻塞；清洗或更換定量環(huán)
c.進樣口密封松動；調(diào)整松緊度
d.進樣針頭尺寸不合適，一般是過短；使用恰當?shù)倪M樣針（注意針頭形狀）
e.廢液管中產(chǎn)生虹吸；清空廢液管
譜圖問題
1、 問：造成峰拖尾的原因是什么，如何消除？
答：a.篩板阻塞；反沖色譜柱、更換進口篩板
b.色譜柱塌陷；填充色譜柱
c.有干擾物質(zhì)的存在；使用更長的色譜柱、改變流動相或更換色譜柱
e.流動相PH值不合適；調(diào)整PH值，對于堿性化合物，低PH值更有利于得到對稱峰
f.樣品與填料表面的溶化點發(fā)生反應；加入離子對試劑或堿性揮發(fā)性修飾劑或更改色譜柱
2、 問：造成峰分叉的原因是什么，如何消除？
答：保護柱或分析柱污染；取下保護柱再進行分析。如果必要更換保護柱。如果分析柱阻塞，拆下來清洗。如果問題仍然存在，可能是柱子被強保留物質(zhì)污染，運用適當?shù)脑偕胧Ｈ绻麊栴}仍然存在，入口可能被阻塞，更換篩板或更換色譜柱。樣品溶劑不溶于流動相；改變樣品溶劑，如果可能采取流動相作為樣品溶劑。
3、 問：K值增加時，拖尾更嚴重，這是為什么？
答：反相模式，二級保留效應；
a.加入三乙胺（或堿性樣品）
b.加入乙酸（或酸性樣品）
c.加入鹽或緩沖劑（或離子化樣品）
d.更換一支柱子
4、 問：保留時間的波動有幾種可能的原因？
答：溫控不當；調(diào)節(jié)好柱溫。流動相組分變化；防止流動相蒸發(fā)、反應等，做梯度時尤其要注意流動相混合的均勻。色譜柱沒有平衡；在每一次運行之前給予足夠的時間平衡色譜柱。
液相色譜常用符號與術(shù)語表
ACN 乙腈 Acetonitrile
AUFS 滿量程的吸光度單位 Absorbance units, full scale
As 峰不對稱因子
B 二元流動相中的強溶劑；例如：反相HPLC的甲醇/水混合液中的甲醇
BSA 牛血清白蛋白（一種蛋白質(zhì)） Bovine serum albumin
CAF 咖啡因（中性溶質(zhì)） Caffeine
CRF 色譜響應因子 Chromatographic response function；色譜圖總分離度的定量指標
dc 色譜柱內(nèi)徑（cm）
DMOA 二甲基辛胺 Dimethyloctylamine
DNB 2,4-二硝基甲酰（基） 2，4-Dinitrobenzoyl
dp 色譜柱填料的粒度（cm）
DRYLAB 液相資源公司（LC Resources INC.)的計算機模擬軟件。DRYLAB I用于等度預測，DRYLAB G用于梯度預測
F 流動相的流速（ml/min）
FC-113 1，1，2-三氟-1，2，2-三氯乙烷
GPC 凝膠滲透色譜法 Gel-permeation chromatography
HA 酸性溶質(zhì)，能電離出A-
Hex 己烷 Hexane
Hr 二相鄰譜帶之間的谷高
HVA 高香草酸 Homovanillic acid
h’ 峰高
h1,h2 相鄰譜峰1和譜峰2的峰高
IEC 離子交換色譜法 Ion-exchange chromatography
IP 離子對 Ion-pair
IPC 離子對色譜法 Ion-pair chromatography
J 色譜峰強度參數(shù)
K’ 所給譜峰的容量因子，k’=(tR-t0)/t0=tR’/t0，tR=t0(1+k’)
k 梯度洗脫過程中，某溶質(zhì)的k’的平均值或有效值
kw 以水做流動相k’的外推值
k1,k2 相鄰譜峰1和譜峰2的容量因子
L 色譜柱長度（cm）
Lc 檢測器流動池光路的長度（cm）
M 溶質(zhì)的分子量
MC 二氯甲烷 Methylene chloride
MDST 混合設計統(tǒng)計技術(shù) Mixture-design statistical technique；一種優(yōu)化流動相的軟件
MeOH 甲醇 Methanol
MTBE 甲基叔丁醚 Methyl-t-butyl ether
MW 溶質(zhì)的分子量
N 色譜柱塔板數(shù)
NAPA N-乙酰普魯卡因胺 N-Acetylprocainamide（堿性溶質(zhì)）
N0 檢測器的基線噪音
ODS 十八烷基硅烷 Octadecylsilyl
P 色譜柱的壓力降[通常以巴（bar）表示，也用psi；另外，也用作柱極性參數(shù)
PA 普魯卡因胺 Procainamide（堿性物質(zhì)）
PAH 聚芳香烴 Polyaromatic Hydrocarbon
PESOS 優(yōu)化流動相的計算機軟件（美國Perkin-Elmer產(chǎn)品）
pKa 溶質(zhì)酸性常數(shù)的負對數(shù)；當pH=pKa時，溶質(zhì)中有一半是電離的
Rk 保留值范圍，Rk=（最末譜峰k’）/（最初譜峰k’）
RRM 相對分離度圖（通常N=10000）
Rs 相鄰二譜峰的分離度
S 當流動相中的%B改變時，測量溶質(zhì)保留值的變化速率的參數(shù)
SAL 水楊酸 Salicylic Acid
SEC 尺寸排阻色譜法 Size-exclusion chromatography
S/N 信噪比 Signal to noise ratio
t 分離時間（min）（樣品進樣時t=0）
tp 梯度系統(tǒng)的滯后時間（min）
TBA 四丁基銨離子 Tetrabutylammonium ion
TEA 三乙胺 Triethylamine
THF 四氫呋喃 Tetrahydrofuran
tk 在用于校正等度洗脫溶劑強度的流動相離開梯度混合器時，梯度洗脫的時間
TLC 薄層色譜法 Thin-layer chromatography
TMA 四甲基銨 Tetramethylammonium（鹽）
TMS 三甲基硅烷 Trimethylsilyl
tO 色譜柱的死時間（min）
tR 溶質(zhì)的保留時間（min）
tG 梯度時間（min），即梯度開始至結(jié)束的時間
t1,t2 相鄰譜峰1和譜峰2的保留時間（min）
ti 色譜圖中第一峰的保留時間（min）
tf 色譜圖中最末峰的保留時間（min）
△tg tf-ti
tx (tf-ti)/2
UV 紫外光
Vm 色譜柱的死體積（mL），Vm=t
VMA 香草扁桃酸 Vanillymandelic acid
wm 化合物的進樣量
w1,w2 相鄰譜峰1和譜峰2于半峰高處（W1/2）的寬度（min）
W1,W2 相鄰譜峰1和譜峰2的基線寬度（min）
W1/2 半峰高處的譜帶寬度
xd,xe,xn 溶劑選擇參數(shù)，分別用于測定溶劑的酸度、堿度和偶極性的程度
? 分離因子，?=k2/k1
△? 梯度洗脫期間流動相成分的變化
?o 溶劑強度參數(shù)
? 化合物的克分子吸收系數(shù)
? 流動相的粘度（Pa?s)
? 流動相中強溶劑的體積份數(shù)
%B 二元流動相中強溶劑的體積百分比（%v）
液相色譜法簡介
氣相色譜不能由色譜圖直接給出未知物的定性結(jié)果，而必須由已知標準作對照定性。當無純物質(zhì)對照時，定性鑒定就很困難，這時需借助質(zhì)譜、紅外和化學法等配合。另外大多數(shù)金屬鹽類和熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)還不能分析。此缺點可高效液相色譜法來克服。在經(jīng)典液相色譜的基礎上，引入了氣相色譜的理論與技術(shù)，在70年代初建立了高效液相色譜分析法（以HPLC表示）。在常壓下操作的液相色譜，分離一個樣品往往長達幾小時至幾十小時，因此工作效率很低。人們曾對這種經(jīng)典液相色譜法試用了柱前加壓或柱后減壓的辦法來提高流速，以縮短分離時間，但是結(jié)果失敗了。根據(jù)液相色譜理論，因為隨著載液（流動相）流速的提高，板高則增大，所以柱效會顯著降低。隨著生產(chǎn)技術(shù)的提高，人們制成了細小（<10?m）而高效的填充物，從而使柱效大大提高。但是隨著填充物粒度的減小，柱壓降顯著增大，為了得到合理的載液流速，使用了高壓；輸液泵，使流速達到1~10mL/min。從而使分析一個多組分樣品只需幾分鐘到幾十分鐘時間。隨著高效固定相、高壓泵和高靈敏度檢測器以及電子技術(shù)和計算機技術(shù)的應用，70年代以業(yè)逐步實現(xiàn)了液相色譜分析的高效、高速、高靈敏和自動化操作。因此人們常稱它為高效液相色譜或現(xiàn)代液相色譜，以區(qū)別于經(jīng)典液相色譜。高效液相色譜法的分類與經(jīng)典液相色譜法一致。按固定相的聚集狀態(tài)不同分為液固色譜法和液液色譜法。按分離原理不同分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠色譜法四類。
高效液相色譜所用基本概念：
保留值等色譜分析有關(guān)術(shù)語，以及分配系數(shù)、分配比、塔板高度、分離度、選擇性等方面均與氣相色譜相一致；高效液相色譜所用基本理論：塔板理論與速率理論也與氣相色譜一致。因液相色譜以液體代替氣相色譜中的氣體作流動相，則速率議程H=A+B/?+C?。式中：縱向擴散項（分子擴散項）B/?對板高的影響與氣相色譜不同，由于液相色譜中組分分子在流動相中的擴散系數(shù)Dm僅為氣相色譜中的萬分之一，因此縱向擴散項對板高的影響可以忽略不計。于是影響液相色譜的主要因素是傳質(zhì)項Cu。由圖14—可知，氣相色譜（GC）的流動相流速u增大時，板高H顯著增大（即柱效顯著降低），而液相色譜（LC）的流速增大時，板高增大不顯著（即柱效降低不顯著）。這說明高效液相色譜也有很高的分離效能，此外，氣相色譜的載氣權(quán)數(shù)種，其性質(zhì)差別也不大，對分離效果影響也不大。而液相色譜的載液種類多，性質(zhì)差別也大，對分離效果影響顯著。因此流動相的選擇很重要，并且在選擇流動相對應注意以下幾點：流動相對樣品有適當?shù)娜芙舛龋慌c樣品發(fā)生化學反應，也不與固定液互溶；流動相的純度要高（至少分析純）、粘度要小，以免帶進雜質(zhì)和組分在流動相中擴散系數(shù)下降；流動相應與所用檢測器相匹配，不應對組分檢測產(chǎn)生干擾作用。高效液相色譜不但具有高效、高速、高靈敏度的特點，還由于它的流動相（載液）種類比氣相色譜的流動相（載氣）多，因此可選用兩種或多種不同比例的液體作流動相，從機時可提高選擇性。此外，液相色譜的餾分比氣相色譜易于收集。便于為紅外、核磁等方法確定化合物結(jié)構(gòu)提供純樣品。由于高效液相色譜法具有以上特點，它適于分離、分析沸點高、熱穩(wěn)定性差、分子量大（大于400）的氣相色譜法不能或不易分析的許多有機物和一些無機物，而這些物質(zhì)占化合物總數(shù)的75~80%。因此它已廣泛用于核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、糖類、脂類、甾類化合物、激素、生物堿、稠環(huán)芳烴、高聚物、金屬螯合物、金屬有機化合物以及多種無機鹽類的分離和分析。但是，高效液相色譜的固定相的分離效率、檢測器的檢測范圍以及靈敏度等方面，目前還不如氣相色譜法。此外對于氣體和易揮發(fā)物質(zhì)的分析方面也遠不如氣相色譜法，因此高效液相色譜法和氣相色譜法配合使用可互相取長補短，相輔相成。
1.分離原理
凝膠色譜，又稱空間排阻色譜。它是利用某些凝膠對混合物各組分因分子量不同，其阻滯作用也不同而進行分離、分析的方法。凝膠色譜的分離要理和其它色譜法不同，它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑要比分子篩大得多，一般為幾百至幾千埃。色譜柱內(nèi)填充具有一定大小孔穴的凝膠。當樣品進入色譜柱后，不同大小的樣品分子（圖14—2中以黑點表示）隨流動相沿凝膠顆粒（圖14—2中以空心圈表示）外部間隙和凝膠孔穴旁流過，體積在的分子因不能滲透到凝膠孔穴里而得到排阻，因此較為順利地通過凝膠柱而較早地被流動相沖洗出來。中等體積的分子產(chǎn)生部分滲透作用，小分子可滲透到凝膠孔穴里去而受阻滯，因有一個平衡過程而較晚地被流動相沖洗出來。這樣，試樣組分基本上按分子大小受到不同阻滯而先后流出色譜柱，從而實現(xiàn)分離目的。光凝膠色譜采用水溶液作流動相進，稱為過濾凝膠色譜（HFC），而用有機溶劑為流動相時，稱為凝膠滲透色譜（GPC）。
2．固定相
凝膠色譜的固定相凝膠，是含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立柱網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。根據(jù)凝膠的交聯(lián)程度和含水量的不同，分了軟質(zhì)、半硬質(zhì)和硬質(zhì)三種。軟質(zhì)凝膠（如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等）交聯(lián)度低，膨脹度大，容量大，可壓宿，不能用于高壓（使用壓力低于
3．流動相
在凝膠色譜中，為提高分率效率，多采用低粘度、與樣品折光指數(shù)相差大的流動相。常用的流動相有苯、甲苯、鄰二氯苯、二氯甲烷、1，2一二氯乙烷、氯仿、水等。
高效液相色譜儀操作步驟
高效液相色譜儀操作步驟：
1)、過濾流動相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。
2)、對抽濾后的流動相進行超聲脫氣10-20分鐘。
3)、打開HPLC工作站（包括計算機軟件和色譜儀），連接好流動相管道，連接檢測系統(tǒng)。
4)、進入HPLC控制界面主菜單，點擊manual，進入手動菜單。
5)、有一段時間沒用，或者換了新的流動相，需要先沖洗泵和進樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進樣閥，需要在manual菜單下，先點擊purge，再點擊start，沖洗時速度不要超過10 ml/min。
6)、調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000。點擊injure，選用合適的流速，點擊on，走基線，觀察基線的情況。
7)、設計走樣方法。點擊file，選取select users and methods，可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。若需建立一個新的方法，點擊new method。選取需要的配件，包括進樣閥，泵，檢測器等，根據(jù)需要而不同。選完后，點擊protocol。一個完整的走樣方法需要包括：a.進樣前的穩(wěn)流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進樣閥的loading-inject轉(zhuǎn)換；d.走樣時間，隨不同的樣品而不同。
8)、進樣和進樣后操作。選定走樣方法，點擊start。進樣，所有的樣品均需過濾。方法走完后，點擊postrun，可記錄數(shù)據(jù)和做標記等。全部樣品走完后，再用上面的方法走一段基線，洗掉剩余物。
9)、關(guān)機時，先關(guān)計算機，再關(guān)液相色譜。
10)、填寫登記本，由負責人簽字。
注意事項：
1)、流動相均需色譜純度，水用
2)、柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要讓液體過柱子。
3)、所有過柱子的液體均需嚴格的過濾。
4)、壓力不能太大，最好不要超過2000 psi。